1605年，長篇巨作《堂吉訶德》問世，立即引起轟動，一年內再版六次，一月之內出現了三個盜印版。1614年一個化名作者出了一部偽《堂吉訶德》，對作家及作品中的人物進行惡毒攻擊，以詆毀作品的社會影響。塞萬提斯憤慨萬分，帶病趕寫續集，於1615年出版《堂吉訶德》第二部。
《堂吉訶德》是塞萬提斯的代表作，全名為《奇情異想的紳士堂吉訶德·台·拉·曼卻》。在前言中，作者稱：他寫這部作品是為了“攻擊騎士小說”，“把騎士小說的那一套掃除幹淨。”在官方的倡導下，當時的西班牙騎士小說十分風行，且在很長時期內占據了文壇的統治地位。這種騎士小說以虛構的情節、幻想的冒險故事取悅讀者，歌頌騎士精神，美化騎士製度，是一種封建性文學。針對這一時弊，塞萬提斯采用以子之矛攻子之盾的方法，仿效騎士小說的形式創作出了《堂吉訶德》。
全書的故事由堂吉訶德的三次冒險遊俠經曆構成。主人公堂吉訶德是西班牙拉·曼卻這個地方的一個窮紳士，時年50來歲。他喜讀騎士小說到了如癡如醉的地步，以致滿腦子都是魔術、比武、戀愛、痛苦等荒誕不經的故事。他想入非非要去做書中那樣的遊俠騎士——周遊天下，建立千古不朽的功勳。於是，他穿著一身祖先留下的破爛生鏽的盔甲，手持長矛，騎著一匹叫作“洛提南特”的瘦馬，悄悄地離開村子外出冒險。按照騎士故事的套路，除了有名馬外，作為一個騎士，還得有一個意中人，他便把鄰村的一位農家姑娘命名為“杜爾西內婭”——意思是“甜蜜溫柔”。堂吉訶德認為他的意中人杜爾西內婭是絕代的佳人、嬌美的公主，立誌終身為她服務，為了她“冒大險，成大業，立奇功”。完全失去現實判斷而沉入漫無邊際幻想中的堂吉訶德，漫遊路上闖了許多禍，吃了很多虧，鬧了許多笑話，“挨夠了打，走盡背運，遍嚐道途艱辛”。直到臨死的時候，他才清醒過來。他悔恨地對他的侄女說：“我從前成天成夜讀那騎士小說，讀得神魂顛倒，現在知道那些書都是胡說八道，隻是如今悔之已晚！”他因此立下遺囑——要他的侄女嫁給一個從未讀過騎士小說的男人，否則，就取消她的繼承權。